2．蛋白質(zhì)N末端氨基酸的DNS化
取0．5mg蛋白質(zhì)樣品，置于有塞玻璃管中。用少量水溶解后，加入0．5m10．2mol/L碳酸氫鈉溶液。再加入0．5mlDNS-CI丙酮溶液，用三乙胺調(diào)至pH9，0-9，5，塞好塞子，于40℃烘箱中反應(yīng)2h，或室溫(25℃左右)放置2—4h，生成DNS-蛋白質(zhì)。
3．DNS蛋白質(zhì)的水解
DNS化反應(yīng)結(jié)束后。真空蒸去丙酮，加入0．5ml6mol幾鹽酸溶解DNS-蛋白質(zhì)。全部移入水解管。抽真空封管，于111℃烘箱中水解18-24h。開管后蒸去鹽酸，加少量水，再蒸干。重復(fù)2—3次以除盡鹽酸。
4．DNS一氨基酸的抽提
將上述水解產(chǎn)物，加O．5ml水，用1mol幾鹽酸調(diào)至pH2—3加入0．5ml乙酸乙酯抽提，分層可在細(xì)長滴管中進(jìn)行。重復(fù)抽提2—3次，將上層抽提液合并于小試管中，抽去乙酸乙酯，置于干燥器中備用。
5．DNS-氨基酸的層析與檢測(cè)
生成的DNS-氨基酸和標(biāo)準(zhǔn)DNS-氨基酸分別進(jìn)行聚酰胺薄膜層析。
(1)聚酰胺薄膜的準(zhǔn)備
將聚酰胺薄膜剪成7cm×7cm的方塊，在距邊0．5cm處畫互為垂直的兩條基線，交叉點(diǎn)為原點(diǎn)。若只做單相層析，則只畫一條基線，在基線上每隔1cm畫一點(diǎn)樣點(diǎn)。
(2)點(diǎn)樣
用毛細(xì)管取樣，點(diǎn)在點(diǎn)樣位置上，點(diǎn)樣直徑應(yīng)小于2mm。若多次點(diǎn)樣，則點(diǎn)一次，吹干一次。
(3)展開
將點(diǎn)好樣的聚酰胺薄膜卷成圓筒形。樣品則在筒內(nèi)，箍以線圈固定。放在小層析槽內(nèi)(可在小干燥器內(nèi)置一培養(yǎng)皿代替)，槽內(nèi)(培養(yǎng)皿)放人5-10ml展開溶劑工，進(jìn)行展開，以溶劑前
沿到達(dá)距頂端0．5cm左右為止(約20min)。取出膜片，吹干。進(jìn)行雙向?qū)游鰰r(shí)，在**向?qū)游鐾戤�，完全吹�?有時(shí)需晾過夜。才能充分吹干)，將聚酰胺薄膜片轉(zhuǎn)90度，用展開溶劑Ⅱ展開。為了區(qū)分DNS-蘇氨酸或者區(qū)分DNS-天門冬氨酸與DNS-谷氨酸，可在溶劑Ⅱ展開后，吹干，接著用溶劑Ⅲ沿同一個(gè)方向展開，只需展開至一半高度即可。為了區(qū)別乞εDNS-賴氨酸、α-DNS-組氨酸與DNS-精氨酸，應(yīng)在溶劑Ⅱ中展開后，吹干，接著在溶劑Ⅳ中沿同一個(gè)方向展開。
(4)DNS，氨基酸的檢測(cè)
展開結(jié)束后，取出薄膜，用電吹風(fēng)機(jī)吹干，在360nn、或280nm的紫外燈下檢測(cè)。DNS一氨基酸呈黃色熒光。此外還有其他顏色的雜點(diǎn)，如DNS-OH顯綠色熒光等。用樣品的層析譜與標(biāo)準(zhǔn)DNS一氨基酸層析譜相比較，可鑒別樣品DNS-氨基酸的種類。
【思考】
1．薄膜層析與其他層析法比較有哪些優(yōu)點(diǎn)？
2．選用展層劑的依據(jù)是什么？
實(shí)驗(yàn)九動(dòng)物基因組DNA的分離純化
【目的和要求】
掌握鹽溶法大量制備動(dòng)物基因組DNA的基本原理和方法。
【實(shí)驗(yàn)原理】
根據(jù)核糖核蛋白與脫氧核糖核蛋白在一定濃度的氯化鈉溶液中的溶解度不同進(jìn)行分離，然后用蛋白質(zhì)變性沉淀劑去除蛋白，使核酸釋放出來，再利用核酸不溶于乙醇的性質(zhì)將核酸析出，達(dá)到分離提純的目的。
在0．14mol/L的氯化鈉溶液中，RNA核蛋白(RNP)溶解度大，而DNA核蛋白(ODNP)溶解度較小；相反，在lmol/L的氯化鈉溶液中，ONP溶解度*大，而RNP溶解度卻很小，從而使DNA、RNA核蛋白分開。核蛋白分離后可用蛋白變性沉淀劑(氯仿 異戊醇、十二烷基硫酸鈉、熱酚等)去除蛋白質(zhì)，釋放核酸，核酸便從溶液中析出。
動(dòng)物肝中含有核糖核酸酶和脫氧核糖核酸酶，因此要保持低溫，要防止Mg2 ，F(xiàn)e2 及c02 等激活離子。
【實(shí)驗(yàn)器材和試劑】
1．試劑：
(1)sc緩沖液：2．94g檸檬酸鈉和9．0g氯化鈉溶于1L蒸餾水。用鹽酸調(diào)pH至7．0。
(2)5SDS溶液
(3)95乙醇、氯仿、異戊醇。
2．器皿
冷凍離心機(jī)、組織搗碎機(jī)、燒杯、量筒、玻璃棒、三角燒瓶、離心管。
【實(shí)驗(yàn)方法】
新鮮豬肝4g，用$13溶液洗去血液，低溫剪碎后，加入8ml上述溶液，繼續(xù)搗碎，將勻漿物于4000r/min離心10min，上層是RNP提取液，下層是DNP及細(xì)胞碎片。將上層傾出(也可留下制備RNA)，下層再用5mlSC溶液重復(fù)抽提兩次，以減少RNP對(duì)DNP抽提的影響。
下層沉淀移入三角燒瓶，加同上溶液20ml，混勻，加4m15SDS混勻。加15ml氯仿/異戊醇(20/1)混合液棍勻，邊搖邊加固體氯化鈉，使其終濃度達(dá)：lmol/L，充分振蕩30rain。4000r/in離心20rain，小心取出離心管，觀察有三層，上層為水相(I)NA溶解在此)，中間乳白色為蛋白質(zhì)沉淀層，下層為氯仿層。甩吸管小心吸取上層。同樣方法去蛋白，至中聞層無蛋白沉淀層為止。
量取上層水相體積后，在燒杯中加等體積冷乙醇(95)，邊鯫邊攪拌(沿一個(gè)方向)，玻璃棒上有纖維狀DNA纏繞，當(dāng)DNA全部繞上后，擠干，再用無水乙醇洗一次，取出于干燥器干燥。稱重，計(jì)算得率。
……
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